Le Polymorphisme gntique Anne universitaire 2015/2016 DR. OULDJAOUI AHMED variation individuelle de nuclotidique Dfinition la squence entranant lexistence au mme locus dau moins 2 formes diffrentes de la squence, appels allles dont la frquence est > 1% dans la population intra ou extra-gnique deffet neutre En dehors dun gne Dans une rgion non codante dun gne
(intron) Dans une rgion codante mais sans altrer la signification (redondance du code Diversit des squences humaines - Pour les 95 % non codants Des estimations donnent: 2 gnomes humains diffrent en moyenne par 1/100 1/500 nuclotides. Si on pouvait comparer entre lADN dorigine paternelle et lADN dorigine maternelle chez un individu on trouvait 10 milliard de diffrence correspondant laccumulation de mutations au cours de lvolution humaine. La proportion totale de bases polymorphiques Index dhtrozygotie
dADN a t estim 1/270pb pour tout Diversit des squences -Pour les 5 % codants humaines Les rgions codantes sont soumises une slection plus importante. La prsence de mutations dans ces rgions est plus faible. Diversit nuclotidique : Nombre de diffrences, rapport la longueur de la squence examine, entre 2 squences prises au hasard dans la population. AGTCCTA..GGAAACTG TTTACGT. AGTGCTA..GGTAACTG TTGACGT. 7500 pb I. Les Marqueurs polymorphes ment toutes ces variations ont t dtectes?
1. RFLP bi-allliques 2. Minisatellites 3. Microsatellites 4. SNP (single polymorphism) nucleotide 1. Polymorphisme de la longueur des fragments de restriction [RFLP: Restriction Fragment Length -polymorphism] Ce sont des variations individuelles de la squence dADN rvles par des modifications de la carte de restriction. Mise en vidence par le Southern qui montre des diffrences obtenues avec une enzyme donne et une sonde donne.
- Les enzymes de restrictions possdent des squences reconnues dans lADN, une mutation au niveau de cet ADN entraine la formation ou la perte de site de reconnaissance, ce qui entraine des modifications dans la taille dun ou plusieurs fragments rvls par Southern. Les sites polymorphes
1/1 1/2 2/2 Allle 1 6.5 kb 1.5 kb 8 kb 6.5 kb Allle 2 8 kb PAS DE SITE INTERNE
Les sites polymorphes 1/1 1/2 2/2 Allle 1 Allle 2 4 kb 8 kb 2.5 kb 8 kb 6.5 kb 4 kb 2.5
kb SITE POLYMORPHE INTERNE Les sites polymorphes 1/1 1/2 2/2 Allle 2.5 1 kb Allle 2 2.5 kb 4 kb 5.5 kb
8 kb 6.5 kb 5.5 kb 4 kb 2.5 kb SITE INTERNE NON POLYMORPHE SITE EXTERNE POLYMORPHE Les sites polymorphes 1/1 1/2 2/2 Allle 1 Allle 2
2.5 kb 2.5 kb 1.5 kb 2.5 kb 4 kb 8 kb 6.5 kb 4 2.5 kb 1.5 kb
kb SITE INTERNE NON POLYMORPHE SITE POLYMORPHE INTERNE 1.1. RFLP bi-allliques : Dans toute squence non codante localisation (97% ADN) Dans une squence codante sans consquence sur la fonction du gne Si le polymorphisme touche la 3me base du codon Allle 1 Allle 2 CAG ATC TTA (site BglII AGATCT) Gln Ile Leu CAA ATC TTA (site BglII absent) Gln
Ile Leu Si le changement dacide amin na pas deffet sur la fonction Cas particulier : la mutation tudie EXEMPLE dun polymorphisme multialllique Le polymorphisme de lapolipoprotine E Protine: E2 E3 E4 AA en 112 Cystine
Cystine Arginine AA en 158 Cystine Arginine Arginine DN: Fragment de 292 pb (9 sites de coupure) Hha I: GCG C CGC = Arginine TGC = Cystine Gnotypage de
lapoE Amplification par PCR Dnaturation : 30 s 95C, Hybridation : 30 s 60C Elongation : 1 min 72C) Digestion de lADN amplifi par Hha I GCGC (TGC cystine CGC Arginine) 2 cys-cys cys cys 62 91 16 GTGC 18
GTGC 62 48 16 72 4 35 7 11 4 7 11
4 GCGC arg 4 arg-arg 11 arg 91 16 7 GTGC cys 3 cys-arg
62 83 18 arg 19 GCGC 18 48 35 GCGC Gnotypage de lapo E
(E2/E2)=91+83+62 (E4/E2)=91+83+72+62+48+35 (E3/E3)=91+62+48+35 E3)=91+83+62+48+35 (E2/ 2. Minisatellites: RFLP multi-allliques VNTR (variable number tandem repeats CTGGATTAGCTTAAGCG T CTTAGTAGGATGGATGG A GGAGGTTCAGGTGAT--GGAGGTTCAGGTGATGG A GGAGGTTCAGGTGATGG G GGAGGTTCAGGTGATGG G GGAGGTTCAGGTGATGG Minisatel lite
PS3 porcin allle 7 rptitio ns 2. 1. Rpartition des minisatellites Rptitions en nombre variable dune squence de 10 50 pb un locus donn Une mme squence de minisatellite va se retrouver diffrents loci sur tout le gnome Analyse locus par locus Analyse de la rpartition dun minisatellite sur le gnome entier 2.2. Minisatellites - mise en vidence des allles un locus
Le contexte autour du minisatellite est spcifique dun locus Analyse par Southern blot ou PCR La sonde shybrident ou les amorces autour du Allle 1 Allle 2 2.3.
minisatellites Southern blot 2 kb 1/1 : 2/2 1/2 3 kb 2 kb 3 kb Digestion par lenzyme Southern blot avec une sonde (
adjacente au minisatellite = spcifique dun LOCUS ) 2.3. minisatellites : PCR Allle 1 1/1 2/2 1/2 Allle 2 PCR avec 2 amorces encadrant le minisatellite = spcifique dun LOCUS
Exemple 2.4. Minisatellites - mise en vidence des allles sur tout le gnome Analyse par Southern blot uniquement (PCR = locus spcifique) La sonde shybride sur le minisatellite Applications : mdecine lgale, tests de paternit 2.5. Minisatellites - empreinte gntique Chaque individu a une empreinte diffrente (sauf les jumeaux monozygotes) :
Utilisation en mdecine lgale - Chaque bande prsente chez un individu doit ltre galement soit chez sa mre soit chez son pre : - test dexclusion de paternit 2.6. Minisatellites rcapitulation Les minisatellites sont: Poly-allliques : grand nombre
dallles diffrents un locus donn (en fonction du nombre de rptitions de la squence) Multi-locus : une mme squence de minisatellite va se trouver diffrents endroits dans le gnome ( chaque fois avec . Microsatellites STR (short tandem repe 1 - 6pb rptes n fois (5 n 40) AAAAAA - mononucleotide ATATAT - dinucleotide AT TAGTAGTAG - trinucleotide TAG TAGTTAGTTAGT - tetranucleotide
TAGT TAGGCTAGGCTAGGC penta TAGGCT nucleotide Ex : TGTGTGTGTG.. 50 000 microsatellites (TG)n dans tout le gnome humain Prsents sur tout le gnome Mise en vidence par PCR exclusivement Migration en gel dacrylamide (plus rsolutif que lagarose) 3.1. microsatellites : PCR Allle 1 1/1 2/2 1/2
Allle 2 PCR avec 2 amorces encadrant le microsatellite = spcifique dun LOCUS 3.1. microsatellites : PCR 4. Single Nucleotide polymorphism = SNP - Causs par mutagnse chimique ou erreurs de rplication - bi-allliques - ratio des allles : 99,99 : 0,01 50:50 - Nb loci identifis chez lHomme >> 5 millions - taux de mutation 1.109/gnration
- en consquence, peu de mutations nouvelles dans lespce Populati on Gnral 94 % 4. Single Nucleotide polymorphism = SNP Mise en vidence : - idal : le polymorphisme correspond un RFLP - PCR-SSCP - Allle-Specific Oligonucleotide (ASO) Micro-arrays - squenage - Populati on
Gnral 94 % Marqueurs gntiques est caractris par des allles correspondant chaque variation possible de la squence degr dhtrozygotie dun marqueur H=1 (pi2) Fonction du nombre et de la frquence de chacun des allles Exemple : 3 allles de frquence 0,2 / 0,3 / 0,5
Htrozygotie est de 1- (0,04+0,09 + 0,25) = 0,62 2 allles de frquence 0,2 / 0,8 : 1- (0,04 + 0,64)= 0,32 II. Applications 1. Gestion de la variabilit gntique 2. Slection assiste par marqueur gntique 3. Mdecine lgale 4. Diagnostic de maladies gntiques - Diagnostic indirect par analyse de liaison - Diagnostic direct 5. Cartographie et clonage MERCI POUR
VOTRE ATTENTION
