Il contributo della Chimica Analitica all'arte e all'archeologia

Il contributo della Chimica Analitica all'arte e all'archeologia

Il vino Secondo le normative CE, si definisce vino ...il prodotto ottenuto esclusivamente dalla fermentazione totale o parziale degli zuccheri contenuti nelle uve fresche pigiate o non, o di mosti di uve, che si trasformano in alcole attraverso la cosiddetta fermentazione alcolica... Il vino senza dubbio uno dei prodotti alimentari di maggior valore sotto molti punti di vista. Innanzitutto legato alla tradizione: in tutto il mondo, esso il simbolo dellItalia, che stata sempre riconosciuta come terra di elezione per la vite, basti pensare al termine Enotria (terra del vino) con cui era nota in epoca greca. Dal punto di vista commerciale esso rappresenta un settore in cui convergono grandi interessi e grandi investimenti. Poi un alimento che negli ultimi anni ha visto crescere vertiginosamente le produzioni ad alta qualit, anche dal punto di vista della sicurezza. Infine, presenta aspetti molto interessanti anche dal punto di vista nutrizionale (considerandone unassunzione moderata) per via delle sostanze nobili che contiene, come i polifenoli, il resveratrolo e i composti aromatici Universit del Piemonte Orientale Facolt di Scienze anno accademico 20062007 Il vino come prodotto di qualit Come un buon olio si ottiene da buone olive e un corretto trattamento, cos un buon vino si ottiene da materie prime buone e dal buon impiego delle pratiche vinicole, a partire dal vigneto per arrivare allimbottigliamento. La qualit del vino non si pu improvvisare. Lepoca del vino al metanolo forse un lontano ricordo

Inoltre, le esigenze dei consumatori sono in continuo aumento, anche perch la cultura del buon bere si sta diffondendo, soprattutto tra i consumatori giovani. Diventa sempre pi difficile ingannare i clienti, che col tempo sono stati educati ad esigere prodotti di qualit anche a costo di un prezzo maggiore. Va anche considerato che il mercato del vino ha un indotto (turismo enogastronomico, manifestazioni fieristiche) in grande evoluzione Un vino DOC, vinificato come si deve, sar sempre riconosciuto come prodotto di grande affidabilit, mentre un vino da battaglia non pu avere vita lunga Importanza commerciale Dal punto di vista commerciale, il vino uno dei punti di forza delleconomia italiana e in particolare piemontese. Nella nostra regione la produzione di vino si aggira sui 3.3 milioni di ettolitri annui, ma quello che impressiona di pi il dato qualitativo: oltre il 70% della produzione rappresentata da vini di categoria

V.Q.P.R.D., ovvero vini DOC (44 denominazioni) e vini DOCG (7 denominazioni) Si tratta quindi di un comparto di altissimo livello, che richiede quindi investimenti conseguenti dal punto di vista della ricerca a supporto della produzione Classificazione dei vini Le tipologie di vini presenti sul mercato sono varie e differiscono per la qualit: Vini da Tavola: sono vini senza alcuna indicazione di provenienza o nome di vitigno o annata di raccolta Vini a Indicazione Geografica Tipica (I.G.T.): provengono per almeno l'85% dalla zona geografica di cui portano il nome e devono rispondere ad alcuni parametri indicati nei disciplinari di produzione Vini a Denominazione Origine Controllata (D.O.C.): si tratta di vini di qualit, originari di una regione ben determinata, le cui caratteristiche enochimiche ed organolettiche devono rispettare i parametri dettati dai disciplinari di produzione Vini a Denominazione Origine Controllata e Garantita (D.O.C.G.): sono prodotti di particolare pregio sottoposti a regole di produzione pi severe rispetto ai vini a denominazione di origine controllata L'Unione Europea riunisce in un'unica categoria i vini da tavola ed i vini ad indicazione geografica (I.G.T.) nella categoria dei vini da tavola, mentre i vini

D.O.C. e D.O.C.G. sono riuniti nella categoria dei vini di qualit prodotti in regioni determinate (V.Q.P.R.D.) Una collocazione particolare hanno poi i vini speciali e fra questi un ruolo importante per tradizione e nobilt rivestono i Vini Spumanti e i Vini Frizzanti, naturali e gassificati Classificazione per grado alcolico In dipendenza del grado alcolico (e con conseguenze non indifferenze dal punto di vista fiscale) possiamo classificare i vini come segue: Vini da Tavola: titolo alcolometrico non inferiore a 8.5%; per i vini prodotti su talune superfici viticole da stabilirsi il titolo alcolometrico volumico totale pu essere portato ad un massimo di 17% (Puglia, Basilicata, Calabria, Sicilia, Sardegna) ad altitudine inferiore a 600 m s.l.m Vini Liquorosi: titolo alcolometrico minimo stabilito non inferiore 15% ne superiore a 22%. Si distinguono dai vini passiti anche per l'aggiunta di mosto di uve concentrato e/o di alcol Vini Passiti e Vinsanti: non esistendo una normativa generale specifica, rientrano quei vini che hanno un tasso alcolico minimo stabilito dai disciplinari di produzione anche se con tasso alcolico effettivo oltre 15% vol. Questi vini non possono essere aggiunti di concentrati o di alcol perch in tal caso rientrerebbero automaticamente nella categoria dei vini liquorosi Vini aromatizzato: vini speciali aventi un contenuto in alcol inferiore a 21%, costituiti in prevalenza da vino addizionato o non di alcole e di

saccarosio ma di sostanze permesse dalle vigenti disposizioni e normative, atte a conferire al prodotto particolari odori e sapori estranei Vini Frizzanti: titolo alcolometrico effettivo non inferiore a 7% Esempio di disciplinare Ogni vino V.Q.P.R.D soggetto ad un disciplinare di produzione che ne vincola la commercializzazione al rispetto di regole precise, riguardanti lorigine delle uve, il metodo di trattamento, ecc.; curiosamente, dal punto di vista analitico i parametri da rispettare sono pochissimi. Nellesempio riportato il disciplinare D.O.C.G. del Barolo D.P.R. 1 luglio 1980: Riconoscimento della denominazione di origine controllata e garantita del vino Barolo Art. 2. - Il Barolo deve essere ottenuto esclusivamente dalle uve del vitigno Nebbiolo delle sottovariet Michet, Lampia e Ros prodotte nella zona di origine Art. 3. - La zona di origine delle uve atte a produrre il Barolo, comprendente i territori dei comuni di Barolo, Castiglione Falletto, Serralunga d'Alba ed in parte il territorio dei comuni di Monforte d'Alba, Novello, La Morra, Verduno, Grinzane Cavour,Diano d'Alba, Cherasco e Roddi ricadenti nella provincia di Cuneo Art. 4. - Le condizioni ambientali e di coltura dei vigneti destinati alla produzione del "Barolo" devono essere quelle tradizionali della zona e comunque unicamente quelle atte a conferire alle uve ed al vino derivato le specifiche caratteristiche di qualit. Sono pertanto da considerarsi idonei unicamente i vigneti collinari di giacitura ed orientamento adatti ed i cui terreni siano preminentemente argilloso-calcarei. La produzione massima ad Ha in coltura specializzata non deve essere superiore a q.li 80 di uva. A tale limite, anche in annate eccezionalmente favorevoli, la produzione dovr essere riportata attraverso un'accurata cernita delle uve purch la produzione non superi del 20% il limite massimo sopra stabilito Esempio di disciplinare

Art. 6. - Le operazioni di vinificazione e di invecchiamento obbligatorio devono essere effettuate nella zona delimitata nell'art. 3. Il Ministero dell'Agricoltura e delle Foreste, sentito il parere del comitato nazionale per la tutela delle denominazioni di origine dei vini pu altres consentire che le suddette operazioni di vinificazione e di invecchiamento obbligatorio siano effettuate dalle aziende che, avendo stabilimenti situati nei territori delle provincie di Cuneo, Asti, Alessandria inclusi nell'art. 4 del disciplinare annesso al D.P.R. 23 aprile 1966, dimostrino che gi effettuarono tali operazioni, previa attestazione della competente camera di commercio Art. 7. - Le uve destinate alla vinificazione, sottoposte a preventiva cemita, se necessario, devono assicurare al vino una gradazione alcolica complessiva minima naturale di gradi 12,5. Nella vinificazione sono ammesse soltanto le pratiche enologiche leali e costanti, atte a conferire al vino le sue peculiari caratteristiche. La conservazione e l'invecchiamento del vino devono essere effettuate secondo i metodi tradizionali. Il vino deve essere sottoposto ad un periodo di invecchiamento di almeno tre anni e conservato per almeno due anni di detto periodo in botti di rovere o di castagno. Il periodo di invecchiamento decorre dal 10 gennaio successivo all'annata di produzione delle uve. consentita l'aggiunta, a scopo migliorativo, di Barolo pi giovane ad identico Barolo pi vecchio o viceversa nella misura massima del 15%. In etichetta, dovr figurare il millesimo relativo al vino che concorre in misura preponderante. Il vino a denominazione di origine controllata e garantita Barolo ultimato il periodo di invecchiamento obbligatorio, dovr essere sottoposto alla prova di degustazione Esempio di disciplinare Art. 8. - Il Barolo, all'atto dell'immissione al consumo, deve rispondere alle seguenti caratteristiche: colore: rosso granato con riflessi arancione;

odore: profumo caratteristico, etereo, gradevole, intenso; sapore: asciutto, pieno, robusto, austero ma vellutato, armonico; gradazione alcolica minima complessiva: gradi 13; acidit totale minima: 5 per mille; estratto secco netto minimo: gr. 23/litro Art. 9. - Il Barolo sottoposto ad un periodo di invecchiamento non inferiore a cinque anni pu portare come specificazione aggiuntiva la dizione riserva. Art. 10. - La denominazione Barolo chinato consentita per i vini aromatizzati preparati utilizzando come base vino Barolo senza aggiunta di mosti o vini non aventi diritto a tale denominazione e con una aromatizzazione tale da consentire, secondo le norme di legge vigenti, il riferimento nella denominazione alla china Esempio di disciplinare Art. 11. - vietato usare assieme alla denominazione Barolo qualsiasi qualificazione aggiuntiva diversa da quelle previste dal presente disciplinare, ivi compresi gli aggettivi: extra, fine, scelto, selezionato e similari. tuttavia consentito l'uso di indicazioni che facciano riferimento a nomi, ragioni sociali, marchi privati, consorzi, non aventi significato laudativo e non idonei a trarre in inganno l'acquirente. consentito altres l'uso di indicazioni geografiche e toponomastiche che facciano riferimento a comuni, frazioni, poderi, tenute, tenimenti, cascine e similari, nonch delle sottospecificazioni geografiche, bricco, costa, vigna e altri sinonimi di uso locale, costituite da aree, localit e mappali inclusi nella zona delimitata nel precedente art. 3 e dalle quali effettivamente provengono

le uve da cui il vino cosi qualificato stato ottenuto Art. 12. - Sulle bottiglie o altri recipienti contenenti il Barolo deve sempre figurare l'indicazione veritiera o documentabile della annata di produzione delle uve. La denominazione di origine controllata e garantita Barolo deve essere sempre messa in evidenza, comunque deve figurare con caratteri di altezza e di larghezza non inferiori a 2/5 di quelli massimi di ogni altra indicazione che compaia sull'etichetta principale della bottiglia Art. 13. - Chiunque produce, vende, pone in vendita, o comunque distribuisce per il consumo con la denominazione di origine controllata e garantita Barolo vini che non rispondono alle condizioni ed ai requisiti stabiliti dal presente disciplinare di produzione, punito a norma dell'art. 28 del D.P.R. 12 luglio 1963, n. 930 Letichetta di un vino In questa figura riportata letichetta di un vino di classe V.Q.P.R.D. In rosso sono riportate le indicazioni obbligatorie, in nero quelle facoltative 1. Nome della regione determinata 2. Dicitura speciale (D.O.C. o D.O.C.G.) 3. Nome dellimbottigliatore 4. Sede dellimbottigliatore 5. Stato

di appartenenza (se esportato) 6. Volume nominale 7. Titolo alcolimetrico effettivo 8. ecologiche C. Indicazioni Titolo alcolimetrico totale 9. G. Lotto Sottozona H. L. O. Q. Distinzioni Annata di raccolta delle uve Menzione vigna Menzioni complementari (es. Riserva, superiore, classico, ecc.) S. Tipo di elaborazione (es. Passito, vino novello, ecc.) Il vino oggetto di studi

Oltre che essere alimento di grande diffusione e consumo in tutto il mondo, il vino anche, probabilmente, lalimento pi studiato dal punto di vista scientifico. Il numero di studi scientifici pubblicati ogni anno impressionante e riguarda argomenti vari nel campo della chimica, della microbiologia, della medicina, dellagronomia, ecc. Ma soprattutto la chimica enologica la disciplina che attrae il maggior numero di ricercatori in tutto il mondo. Sar probabilmente per il grande fascino che esercita la chimica del vino, cos complessa e in parte ancora inesplorata Il Professor Amerine, luminare della University of California a Davis, dichiar che se fosse stato un giovane in procinto di intraprendere lattivit di produttore di vino, avrebbe dapprima studiato chimica, in modo da capire a livello microscopico i processi che favoriscono la nascita di un buon vino Analisi del vino Come per molti altri alimenti, le analisi sul vino riguardano pi aspetti: laspetto normativo, legato a parametri analitici che ogni prodotto enologico deve rispettare per poter essere commercializzato: grado alcolico, acidit totale, parziale e fissa, estratto secco, ecc., anche se i disciplinari di produzione sono poco restrittivi da punto di vista questo laspetto nutrizionale, legato alle propriet

benefiche (o anche malefiche) che il vino apporta alla nostra salute, attraverso lassunzione di sostanze antiossidanti come i polifenoli che pu essere interessante dosare nelle varie classi in cui esistono laspetto qualitativo, legato principalmente allaroma e al bouquet del vino e quindi alle centinaia di sostanze volatili di cui ricco il vino, sostanze in parte ancora non ancora identificate e quantificate Alcune applicazioni analitiche Le analisi sono importanti in pi punti della filiera del vino, dal prelievo delle uve alla commercializzazione del prodotto imbottigliato: Controllo di qualit: valutare il grado di maturazione delle uve, leffetto dei vari passaggi del processo, il grado di invecchiamento Riduzione dei processi degradativi: identificare le sostanze che apportano contributi negativi al vino e capirne lorigine Miscelazione: stabilire, attraverso la misurazione di parametri ben precisi, quali siano i rapporti ottimali di miscelazione per ottenere un prodotto con le caratteristiche desiderate Certificazione per la commercializzazione: poter soddisfare i

requisiti richiesti per lottenimento della D.O.C. Certificazione per lesportazione: poter soddisfare i requisiti richiesti per lesportazione dei prodotti sui mercati esteri Normative sui metodi di analisi A livello di Comunit Europea, il Regolamento CE n.2676/90 determina i metodi danalisi comunitari da utilizzare nel settore del vino. In questa normativa, tutti i parametri importanti per gli aspetti di sicurezza alimentare sono descritti nei minimi particolari. Successivi aggiornamenti hanno apportato modifiche ai metodi o hanno introdotti metodi nuovi, in conseguenza dellevoluzione degli studi scientifici in campo enochimico La legislazione Italiana, come quelle di altri paesi europei, fa riferimento a quella comunitaria, recependone i regolamenti per quanto riguarda i metodi danalisi da utilizzare. Per quanto riguarda i limiti massimi di concentrazione per le sostanze indesiderate nel vino, invece, non ci sono ancora regole comuni. Al proposito, sufficiente valutare i limiti massimi per il contenuto di metalli nel vino, mostrati nelle tabelle seguenti in cui sono confrontati i limiti stabiliti da alcuni paesi Limiti per metalli non tossici N azioni Ag Al B

A r gent ina A ust r alia Canada Ger mania Ca Cr 0.25 Cu 1.0 5.0 0.5 8.0 80.0 I t alia Fe Na Sn T i Zn 230 0.15 0.2 50.0 20.0 500 0.02

5.0 5.0 2.0 1.0 1.0 5.0 10.0 5.0 N uova Zelanda 2.0 Russia 5.0 10.0 0.15 S ud A f r ica 80.0 1.0 10.0 100 S vizzer a

80.0 1.0 US A Sb Se 40.0 5.0 1.0 100.0 5.0 60 5.0 0.5 F A O/ W H O EU OI V 1.0 10.0 0.1 1.0

60 0.20 0.1 5.0 5.0 FAO/WHO: Food and Agricolture Organization / World Health Organization OIV: Organisation International de la Vigne et du Vin Limiti per metalli tossici N azioni A s Cd A r gent ina A ust r alia Br asile Canada Ger mania I t alia Malt a N uova Zelanda Russia S ud A f r ica S vizzer a US A Hg

0.01 Pb 0.20 0.1 0.05 0.030 0.20 0.1 0.50 0.100 0.1 0.01 0.010 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.20 0.50 0.20 0.25 0.30 0.20 0.20 0.03 0.005 0.30 0.01 0.050 0.20 0.01 0.10 0.30 F A O/ W H O

0.20 EU 0.20 OI V 0.2 0.01 0.020 0.20 FAO/WHO: Food and Agricolture Organization / World Health Organization OIV: Organisation International de la Vigne et du Vin Composizione del vino Nel vino sono presenti centinaia di composti diversi (attualmente sono note non meno di 600 sostanze) ed interessante notare che le propriet organolettiche non sono influenzate soltanto dai suoi componenti maggiori, cio acqua e alcol etilico, ma anche dai componenti minori e persino da quelli presenti in tracce e ultratracce. Per esempio, sufficiente una concentrazione di poche decine di ng/l di 2,4,6-tricloroanisolo per impartire al vino il classico, sgradevole gusto di tappo piuttosto difficile delineare una descrizione della composizione media del vino, viste le numerose possibilit di tecniche di vinificazione. Sono sempre presenti composti delle seguenti classi: Acqua

Polifenoli: antociani, tannini Alcoli: etanolo, metanolo, Sostanze minerali: anioni, alcoli superiori, glicerina cationi Acidi organici: tartarico, Sostanze volatili: acidi volatili, malico, citrico, lattico, acetico esteri, aldeidi, terpeni Zuccheri: glucosio, fruttosio Vitamine Gomme e pectine Gas disciolti: anidride carbonica, anidride solforosa, ossigeno

Composizione e qualit Ogni produttore di vino sa che per fare un buon prodotto necessario realizzare larmonia tra i vari componenti del vino. Ad esempio, aumentare artificialmente la gradazione alcolica del vino serve a poco se questo non bilanciato da un equivalente corredo di sostanze aromatiche A livello chimico, la qualit di un vino determinata da una serie di sostanze tra le quali hanno particolare importanza le seguenti: Alcol etilico Estratto secco netto Zuccheri (fruttosio, glucosio) Acidit (acidi carbossilici) Polifenoli (antociani, stilbeni, flavanoli, ecc.) Anidride carbonica Composti aromatici (terpeni, esteri, alcoli superiori, aldeidi, ecc.) Alcol etilico La sua importanza, dal punto di vista merceologico e commerciale, determinante essendo la sostanza a maggior concentrazione dopo lacqua e quindi influenza notevolmente tutto il complesso dei caratteri organolettici. Oltre al sapore dolce, lalcol etilico o etanolo responsabile della morbidezza del vino. inoltre importantissima la sua capacit di solubilizzare tutti i composti importanti ai fini della costituzione del bouquet, che non sarebbero solubili in un mezzo esclusivamente acquoso. Infine decisivo dal punto di vista della genuinit, in quanto possibile riconoscere laddizione di zucchero non proveniente dall'uva per aumentare il grado alcolico in base alla misura di parametri analitici sullalcol Lalcol etilico o etanolo si forma dalla fermentazione alcolica del glucosio presente nel mosto, favorita dallazione dei lieviti

Saccharomyces Cerevisiae: C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 Titolo alcolometrico Il contenuto di etanolo nel vino si esprime attraverso il titolo alcolometrico volumico, di cui bene distinguere tre varianti: Il titolo alcolometrico potenziale, che quantifica lalcol potenzialmente sviluppabile da zuccheri non ancora fermentati, e si misura moltiplicando per 0.06 la quantit nel vino di zuccheri riduttori, espressa in g/l; questo fattore moltiplicativo deriva dalle unit Brix necessarie per generare un volume di etanolo pari a 1% (v/v) attraverso la fermentazione alcolica. Lunit Brix esprime la percentuale di solidi totali in soluzione, calcolata in g di soluto/100 g di soluzione; nel mosto, il 95% dei solidi disciolti zucchero che quindi esprime quasi interamente i Brix Il titolo alcolometrico effettivo, che quantifica letanolo presente Il titolo alcolometrico totale, dato dalla somma del titolo effettivo e potenziale Determinazione delletanolo Il metodo pi semplice per determinare il grado alcolico di un vino quello ebullioscopico, nel quale cio si misura il punto di ebollizione del campione. Considerando il vino una miscela binaria acquaetanolo, possibile risalire alla % di etanolo nel campione in base alla temperatura alla quale esso bolle, facendo riferimento al grafico sottostante; labbassamento del punto

di ebollizione dellacqua (abbassamento ebullioscopico) infatti funzione quasi lineare dellaggiunta di un altro componente In alternativa si pu eseguire lanalisi GC, determinando letanolo insieme agli altri alcoli, oppure lanalisi HPLC Misura densimetrica delletanolo Un altro metodo semplice e correntemente utilizzato per determinare il titolo di etanolo quello densimetrico, che si basa cio sulla misurazione della densit. Il valore di densit di una miscela binaria acqua-etanolo correlabile al grado alcolico; la misura si effettua a 20C, oppure apportando una correzione se a temperatura diversa. Il vino in

esame sottoposto a distillazione per eliminare tutte le sostanze non volatili; nel distillato si concentrano anche composti omologhi delletanolo nonch gli esteri etilici, che contribiscono quindi al valore finale. Attraverso la determinazione della densit del distillato con bilancia idrostatica, si estrapola da tabelle di riferimento il valore del grado alcolico effettivo La bilancia idrostatica funziona in base al principio di Archimede, secondo cui un corpo immerso in un liquido riceve una spinta verticale uguale al peso del liquido spostato. Il peso diviso il volume impiegato dar il valore Altri alcoli Il vino contiene altri alcoli che possono influenzarne la qualit, in senso positivo o negativo. Tra quelli apprezzabili vi la glicerina o glicerolo, prodotta come letanolo nella fermentazione alcolica La glicerina impartisce al vino un sapore CH2 OH marcatamente dolciastro e contribuisce a CH OH migliorarne lequilibrio e il corpo. Essendo un CH2 OH

composto non troppo volatile, la sua determinazione si effettua per separazione HPLC Un altro alcol, questa volta meno desiderabile, l alcol metilico o metanolo (CH3OH) che si forma dallidrolisi enzimatica della pectina, un polisaccaride presente nelluva. Pur essendo tossico, il suo contenuto nel vino non costituisce rischio, a meno di quantit fraudolentemente aumentate (come nel caso tristemente noto di Narzole). La sua determinazione si effettua normalmente per GC Alcoli superiori I cosidetti alcoli superiori o fusel oils, cio alcoli con pi di due atomi di carbonio, si originano dagli aminoacidi presenti nelluva: nel vino i pi importanti sono 1-propanolo, 2-metil-1-propanolo, 3metil-1-butanolo e 2-metil-1-butanolo Gli alcoli superiori influenzano in vario modo il gusto del vino; nel Cabernet Sauvignon ne stato identificato uno particolare, il 3metiltio-1-propanolo (CH3-S-CH2-CH2-CH2-OH) che deriva dallaminoacido metionina e impartisce al vino una forte nota dolce La determinazione degli alcoli superiori si pu effettuare per GC. Nel cromatogramma sono riconoscibili i seguenti composti, in ordine di eluizione: 1-propanolo, etil

acetato (un estere), 2-metil1-propanolo, 1-butanolo (standard interno), etil acetale (un etere), 3-metil-1butanolo e 2-metil-1-butanolo Estratto secco netto un parametro importante: d l'idea della robustezza del vino. Ad esso contribuiscono le sostanze non volatili lasciate dopo levaporazione delletanolo, quindi composti diversi come gli acidi fissi tartarico, malico e lattico, la glicerina, le materie coloranti, i tannini, le sostanze minerali e gli zuccheri, anche se questi ultimi contribuiscono pi correttamente allestratto secco apparente, potendo generare altro etanolo L'estratto secco netto, il cui valore si esprime in g/l, legato al tipo di vino ed alla tecnica di vinificazione. I vini rossi, a causa della presenza delle materie coloranti e dei tannini, hanno solitamente un estratto superiore a quello dei bianchi. L'estratto secco netto uno dei parametri previsti dai disciplinari dei vini D.O.C. e D.O.C.G., ed entra quindi a far parte degli elementi di giudizio sulla genuinit. Ci particolarmente vero per quanto riguarda la correlazione fra il valore dell'estratto e il valore delle ceneri di un vino. Infatti il contenuto in ceneri di un vino normalmente circa 1/10 del valore dell'estratto secco netto La determinazione si effettua per densitometria, misurando la differenza tra la densit del campione di vino e quella del distillato alcolico (privo delle sostanze che compongono lestratto). Nelleffettuare la determinazione, necessario porre attenzione a non arricchire il distillato in sostanze debolmente volatili come lacido malico, il glicole etilenico o la stessa acqua Zuccheri

Rappresentano una parte importante del mosto e quindi del vino e sono costituiti principalmente da fruttosio (levulosio) e glucosio (destrosio): il primo ha struttura furanosidica, cio a 5 atomi OH di carbonio, mentre il secondo ha struttura HOCH2 O piranosidica, cio a 6 atomi di carbonio. I due H HO CH2OH H zuccheri vengono fermentati dai lieviti OH H naturalmente presenti nel mosto con produzione di alcol; quando la fermentazione fruttosio terminata non sono pi presenti o si ritrovano in tracce. Altri zuccheri piranosidici nel mosto sono CH2OH O H il ramnosio, larabinosio e lo xilosio

H H Oltre ai monosaccaridi citati, nelluva sono OH H HO OH presenti disaccaridi come il saccarosio (fruttosio H OH + glucosio) e polisaccaridi come la pectina (acido galatturonico) e le gomme (arabinosio, glucosio galattosio) Secondo il tenore di zuccheri presenti i vini ovviamente i vini dolci e liquorosi contengono una quantit di vengono classificati come pi secchi, amabili, zuccheri non fermentati elevata

che dolci, ne conferisce il sapore ecc.; dolce Rapporto glucosio/fruttosio Glucosio e fruttosio nel mosto si trovano inizialmente in quantit pressoch uguali per cui il loro rapporto varia tra 0.7 e 1.1, a seconda di fattori come il grado di maturit delle uve, le condizioni climatiche e naturalmente la variet di uva. Durante la fermentazione alcolica, il glucosio viene consumato per primo dai lieviti: ci comporta una sua diminuzione e il rapporto fra i due zuccheri, al procedere della fermentazione, si allontana sempre di pi dall'unit, fino ad arrivare alla fine attorno a 0.25. Nel caso di vini dolci e nei casi in cui non consentita la dolcificazione, il valore di questo rapporto pu rappresentare un elemento di controllo della genuinit Nel vino non presente naturalmente il saccarosio. Le piccole quantit che si trovano nell'uva all'atto della spremitura spariscono rapidamente nel giro di qualche ora per idrolisi, quindi uneventuale addizione fraudolenta difficile da rivelare. Nei casi sospetti, la ricerca del saccarosio e dei suoi derivati di idrolisi (glucosio e fruttosio) uno dei parametri di controllo della genuinit Inositolo Sempre nell'ambito del controllo della genuinit, un elemento di notevole valore diagnostico costituito dalla presenza di due composti che vengono collocati nel quadro zuccherino naturale dei vini: mio-inositolo e scillo-inositolo. La determinazione del contenuto di questi due polialcoli ciclici e il rapporto fra le loro

concentrazioni assume un significato rilevante agli effetti del controllo della genuinit mio-inositolo scillo-inositolo Determinazione degli zuccheri riducenti La determinazione degli zuccheri si pu effettuare con tecniche diverse. Una determinazione classica quella degli zuccheri riducenti: essendo il glucosio e il fruttosio composti riducenti in virt del gruppo alcolico e del gruppo aldeidico, possibile determinarne la quantit totale (comprensiva anche dei pentosi, zuccheri non fermentabili ma ugualmente riducenti) mediante il metodo di Rebelein che consiste nel fare reagire gli zuccheri con una soluzione di Cu2+ in ambiente basico: Zucchero + Cu2+ prodotto ossidato + Cu+ Lo ione Cu2+ addizionato in quantit nota sotto forma di reattivo di Fehling, composto da due soluzioni di cui una contenente CuSO45H2O e laltra contenente tartrato di sodio e potassio in idrossido di sodio. Dopo la reazione redox, leccesso di Cu2+ fatto reagire con KI in ambiente di H2SO4 e si titola lo iodio sviluppatosi con Na2S2O3 in presenza di indicatore salda damido: 2Cu2+ + 2I- 2Cu+ + I2 I2 + 2S2O32- 2I- + S4O62Per lanalisi dei vini rossi o di vini ricchi di polifenoli bene eliminare i Determinazione cromatografica La separazione cromatografica degli zuccheri possibile con HPLC su

colonna di silice con gruppi aminici e fase mobile acqua/acetonitrile. Per la rivelazione si impiega normalmente il detector a indice di rifrazione, basato sulla capacit di una sostanza in soluzione di deviare un raggio luminoso; in alternativa, essendo gli zuccheri composti riducenti in virt del gruppo alcolico e del gruppo aldeidico, possibile utilizzare un rivelatore amperometrico nel quale i vari composti separati sono sottoposti ad una reazione elettrochimica 1. iso-Eritritolo 2. Fruttosio 3. Sorbitolo 4. Mannitolo 5. Glucosio 6. Inositolo 7. Saccarosio 8. Maltitolo 9. Maltosio Acidit del vino L'acidit conferisce al vino vivacit nel gusto e nel colore: si tratta quindi di un parametro apprezzabile, se dovuto agli acidi giusti Gli acidi presenti nel vino sono classificabili in acidi naturali, presenti nelluva (tartarico, malico e citrico) e in acidi di origine fermentativa (acetico, lattico e succinico). Ogni acido conferisce note particolari e positive se in concentrazione opportuna; lacido malico preferibilmente convertito ad acido lattico nella fermentazione malolattica in quanto d note acerbe, mentre lacido acetico ovviamente mantenuto al minimo per evitare linsorgere di acescenza L'acidit totale del vino costituita dalla somma dell acidit volatile, data principalmente dallacido acetico, e dell'acidit fissa,

data da acido tartarico, malico, lattico e in misura minore acido succinico e altri acidi. Lacidit totale convenzionalmente espressa in g/l di acido tartarico in quanto lacido presente in misura preponderante nell'uva e nel mosto Le tecnologie di trasformazione e di vinificazione influenzano in modo determinante il quadro acidico finale del vino, che va quindi controllato attentamente mediante la determinazione analitica dei parametri di acidit (totale, volatile e fissa) e dei singoli acidi Determinazione dellacidit Lacidit totale del vino effettuata con titolazione acido-base con una soluzione a titolo noto di NaOH, rilevando il punto di equivalenza in presenza di indicatore blu di bromotimolo oppure seguendo la titolazione per via potenziometrica con un elettrodo. Normalmente lanalisi si effettua dopo avere allontanato lanidride carbonica presente, che potrebbe falsare il punto importante comprendere la didifferenza equivalenza. tra acidit totale e acidit titolabile: la prima il contenuto totale di acidi organici nel vino, mentre la seconda la concentrazione totale di ioni H+ nel vino, minore dellacidit totale in quanto gli acidi nel vino sono in parte neutralizzati da ioni Na+ e K+. Quindi lacidit totale uguale a [H+] + [Na+] + [K+] Oltre allacidit totale, utile determinare lacidit volatile dovuta principalmente allacido acetico. Si misura in maniera analoga allacidit totale sul distillato ottenuto in corrente di vapore d'acqua, con lapparecchiatura mostrata in figura. In questo

caso necessario sottrarre dal valore determinato il contributo di sostanze che passano nel distillato: biossido di zolfo libero e combinato, acido sorbico e acido salicilico eventualmente aggiunti al vino L acidit fissa, dovuta agli acidi organici non volatili, si misura per differenza tra lacidit totale e quella volatile Determinazione del quadro acido Oltre ai parametri di acidit, utile la determinazione dei singoli acidi organici, in quello che noto come il quadro acido. I principali acidi che lo compongono sono i seguenti: Acido tartarico, lacido caratteristico delluva, in parte perso per precipitazione come potassio bitartrato Acido malico, la cui concentrazione limitata nei vini rossi dalla fermentazione malo-lattica

Acido citrico, la cui presenza artificiale se al di sopra di 800 mg/l Acido succinico, formato dalla fermentazione alcolica Acido lattico, formato dalla fermentazione malolattica Acido acetico, formato dallossidazione dellacetaldeide e dalla fermentazione acetica COOH H HO C OH COOH C H COOH H C H HO C H

Acido tartarico COOH Acido malico CH2COOH HO C COOH COOH CH2COOH Acido citrico H H C H H C H COOH COOH C OH

Acido succinico CH3 Acido lattico CH3COOH Acido acetico Acidi minori sono il formico, lossalico, il piruvico e il gluconico Quadro acido con HPLC La determinazione del quadro acido si effettua con tecniche cromatografiche. Si pu utilizzare la cromatografia HPLC, separando gli acidi in forma protonata e quindi meno polare, su una colonna C18 con fase mobile acqua/acetonitrile oppure solo acquosa, e rivelazione spettrofotometrica a 210 nm Quadro acido con IC Altra tecnica impiegata la cromatografia ionica. In questa tecnica, gli acidi sono separati in forma parzialmente ionizzata, utilizzando una variante nota come esclusione ionica. Si utilizza acido eptafluorobutirrico come fase eluente e rivelazione conducimetrica. Gli acidi sono eluiti in ordine di pK crescente, ovvero gli acidi pi forti per primi e gli acidi pi deboli per ultimi Normalmente si effettua una diluizione 1:25-1:50 del campione per ridurre la possibilit

di interferenze da parte di sostanze fenoliche; inoltre, essendo la concentrazione di acido tartarico molto elevata, la diluizione ne riporta il livello a valori opportuni Polifenoli Dopo i carboidrati e gli acidi, i polifenoli o composti fenolici sono il gruppo pi abbondante di costituenti chimici delluva. N el vino hanno un ruolo importantissimo: innanzitutto sono responsabili delle differenze tra vini bianchi e vini rossi, soprattutto per colore e aroma, in particolare contribuendo al gusto amaro e all astringenza del vino; in secondo luogo, hanno propriet antiossidanti e battericide, particolarmente gradite dal punto di vista salutistico; infine hanno un ruolo primario nella conservazione e nellinvecchiamento del vino A livello macroscopico, i polifenoli rappresentano la parte colorata e colorante del vino. Sono composti contenuti nella buccia dell'uva e la loro presenza nel vino dipende dalla tecnica di vinificazione. Il contatto pi o meno prolungato del mosto con le bucce ne determina il contenuto nel mosto e quindi nel vino. In base al contenuto di polifenoli si possono classificare i vini come bianchi,

rosati, rossi, rossissimi e torchiati. I vini bianchi hanno un contenuto in polifenoli inferiore rispetto ai vini rossi Benefici dei polifenoli In campo enologico ed igienico-sanitario ormai largamente condivisa la teoria che il vino abbia una notevole azione cardioprotettiva. Studi epidemiologici e prove sperimentali condotte sull'uomo hanno dimostrato che il vino rosso riduce l'incidenza dell'arteriosclerosi coronarica pi di ogni altra bevanda alcolica. Successive indagini hanno altres provato che i polifenoli hanno una potente azione antiossidante capace di inibire la formazione di lipoproteine ossidate (LDL) nell'uomo. Gli studiosi sembrano unanimemente concordi nell'attribuire tale importante azione terapeutica ai polifenoli e principalmente al Resveratrolo, composto contenuto nella buccia dell'uva e che induce nella bacca un tipo di resistenza ad infezioni da funghi Paradosso francese Il termine French paradox (Paradosso francese) stato coniato nel 1991 a proposito del fatto che, nella popolazione francese, l'incidenza di infarto del miocardio circa la met Stati Uniti e al Nordeuropa, agli rispetto nonostante la dieta del Francesi sia basata su un consumo di burro ed altri grassi animali altrettanto elevato Ormai acclarato che la spiegazione consiste nell'abitudine diffusa ad un moderato consumo di vino rosso,

alimento ricco di sostanze antiossidanti come sono i polifenoli Attivit antiossidante Per chiarire la potenzialit dei polifenoli in termini di salute, valutiamo lattivit antiossidante dei vini rossi in confronto con il loro contenuto di polifenoli totali e di antociani. Nellanalisi di 19 vini rossi del Trentino, si nota una correlazione strettissima tra i parametri considerati Ormai acclarato che la spiegazione consiste nell'abitudine diffusa ad un moderato consumo di vino rosso, alimento ricco di sostanze antiossidanti come sono i polifenoli Classificazione dei polifenoli OH Chimicamente i polifenoli si distinguono per la presenza di due o pi gruppi fenolici, e sono suddivisibili nelle seguenti famiglie: R4

Flavonoidi, sostanze pigmentate con struttura caratteristica costituita da due gruppi benzenici uniti da un eterociclo con un atomo di ossigeno R3 2' B 1 R O 7 A R1 2 C R5 4' 5'

R6 3 4 5 3' R2 O OH Acidi fenolici, come gli acidi benzoici e gli acidi cinnamici derivati degli acidi fenolici, come gli stilbeni tra cui il resveratrolo OH OH OH HO OH

Polifenoli nei vini bianchi Nella vinificazione in bianco, essendo scarso lutilizzo delle bucce HO degli acini, passano nel vino principalmente i polifenoli contenuti nella polpa, che sono prevalentemente di tipo non flavonoide. HO COOH Prevalgono gli acidi idrossibenzoici (acido gallico, vanillico, siringico, salicilico, gentisico), gli acidi idrossicinnamici (acido HO cumarico, caffeico, ferulico) e i loro esteri con lacido tartarico Acido gallico (acido coutarico, caftarico, fertarico) che sono i polifenoli maggiori nei flavonoidi, vini bianchisono presenti polifenoli a struttura Oltre ai non flavonoide chiamati flavan-3-oli, tra cui prevalgono la catechina e lepicatechina, composti che contribuiscono H HO significaticamente al profilo sensoriale. Derivati delle C COOH catechine sono le procianidine e gli esteri con lacido HO C OH gallico OH

OH HO HO H OH Acido caffeico O O OH OH OH HO OH OH Catechina O C COO

HO C H OH OH H HO OH Procianidina COOH OH H C H COOH C Acido caftarico o trans-caffeoiltartarico Polifenoli nei vini rossi R1

Nella vinificazione in rosso sono presenti tutti i polifenoli citati pi altre famiglie di composti flavonoidi che sono contenuti in prevalenza nelle bucce. Essi sono: Flavan-3,4-dioli o leucoantocianidine Flavonoli, composti che hanno quasi sempre un residuo di glucosio, tra cui la quercetina, la miricetina e il kaempferolo Antociani, i composti per eccellenza legati al colore del vino rosso Tannini, composti polimerici di

origine anche non flavonoide e di grande importanza nelle caratteristiche organolettiche dei vini, in particolare di quelli invecchiati OH HO O 4 OH R2Flavan-3,4-diolo 3 OH OH R1 OH Flavonolo HO O

R2 OH OH O R1 OH HO O R2 + OH OH Antocianina Determinazione dei polifenoli Come per gli zuccheri e per lacidit, la determinazione dei polifenoli ha significato a livello dei singoli composti oppure sullinsieme dei composti della medesima famiglia Per quanto riguarda la determinazione totale dei composti fenolici, il metodo pi noto quello dellIndice di Folin-Ciocalteau, nel quale

si utilizza la spettrofotometria UV-visibile. Si utilizza il reattivo di Folin-Ciocalteau (miscela di acido fosfotungstico, H 3PW12O40, e acido fosfomolibdico, H3PMo12O40) che in presenza di composti fenolici si riduce a miscela di ossidi di tungsteno e molibdeno (W8O23 e Mo8O23); la colorazione blu sviluppata ha un massimo di assorbimento a 750 nm. Convenzionalmente il risultato della misura spettrofotometrica si esprime in mg di acido gallico per litro di vino (GAE) Il metodo molto pratico da eseguire, anche se ha scarsa selettivit, in quanto misura il numero di gruppi fenolici presenti nel campione, quindi anche quelli dei monoidrossifenoli, ed inoltre sensibile a sostanze facilmente ossidabili come lacido ascorbico, lanidride solforosa e gli zuccheri riducenti nei vini dolci Determinazione cromatografica La determinazione dei singoli polifenoli piuttosto complessa, in quanto non ci sono reazioni selettive che si possano sfruttare per effettuare ad esempio misure spettrofotometriche. La tecnica pi idonea a determinare singolarmente i composti fenolici la cromatografia, e in particolare, essendo i polifenoli composti non volatili, la tecnica HPLC Esistono metodi di separazione HPLC che consentono di determinare un quadro polifenolico abbastanza ampio, anche se mai esaustivo: abbiamo visto come sotto la denominazione polifenoli rientrino in realt composti piuttosto diversi, che dal punto di vista cromatografico hanno comportamento sicuramente differente. Per cui la separazione cromatografica possibile per alcuni dei pi importanti composti fenolici, generalmente

impiegando metodi in gradiente, che consentono nella stessa corsa cromatografica di modificare le caratteristiche della fase mobile in modo da includere nella separazione famiglie diverse di polifenoli In alternativa, esistono metodi di pretrattamento che consentono di isolare una o pi famiglie di polifenoli che possono essere poi determinate con maggiore accuratezza Esempi di separazione di polifenoli In questo esempio riportato il cromatogramma di una miscela standard di polifenoli (A) separati su colonna C18 con una fase fissa acqua/metanolo/acido acetico in gradiente di metanolo. La rivelazione spettrofotometrica a 280 nm I polifenoli separati sono di tipo A flavonoide e non flavonoide. Nel cromatogramma B mostrata lanalisi di un vino rosso iniettato direttamente in colonna; il risultato migliora nettamente dopo estrazione liquido-liquido con

dietiletere (C). Si noti il picco del resveratrolo (13) B C Gli antociani Gli antociani sono composti polifenolici del gruppo dei flavonoidi. Essi vengono sintetizzati nelle bucce delluva, ai cui frutti impartiscono il colore che, a seconda degli antociani presenti, pu essere verde-giallo, rosa, rosso, rosso-violetto, rosso-nero e blu-nero Nelluva Vitis vinifera esistono cinque tipi di antocianine: Cianidina, Delfinidina, Malvidina, Peonidina e Petunidina Esistono poi alcuni derivati di questi cinque composti-base, in particolare gli esteri formati dal glucoside con lacido acetico e p-cumarico

Equilibrio tra le forme Gli antociani si trovano in strutture diverse a seconda del pH Determinazione degli antociani La determinazione del profilo antocianico interessante dal punto di vista tassonomico, essendo questi composti tipici delle uve da cui deriva il vino e quindi teoricamente utili per riconoscere i vitigni impiegati. La separazione si effettua con tecnica HPLC su colonna C18 e fase mobile acqua/acetonitrile, normalmente in gradiente di solvente organico. La fase mobile ha pH acido (< 1.5) per avere le antocianine omogeneamente nm, in forma di ionea pH flavilio, quale in particolare moltoilacido presenta un massimo di assorbimento 520 Questa a separazione consente di determinare separatamente le 5 antocianine e i loro derivati esterei con gli acidi acetico, cumarico e caffeico Il Resveratrolo

Il pi importante tra i polifenoli sicuramente il composto 3,5,4triidrossistilbene, pi noto come trans-resveratrolo, appartente alla classe degli stilbeni. Questa sostanza, presente in molte piante ma in misura prevalente nelluva, diventata oggetto di numerosissime ricerche per le sue ormai accertate virt medicamentose Lorigine di questo interesse sta nel fatto che la sua presenza stata identificata in formulazioni erbali della tradizione popolare giapponese; attualmente, si ritiene che abbia propriet antiinfiammatorie e anticoagulanti utili per la protezione dallaterosclerosi e dalle malattie cardiovascolari In pi, sembra che il resveratrolo possa inibire eventi cellulari associati allinsorgere e al procedere di tumori e ridurre la morte cellulare per stress ossidativi In definitiva, si tratta di uno dei composti pi nobili presenti nel vino Il Resveratrolo nel vino Dal punto di vista biochimico, la sintesi del resveratrolo causata in risposta a infezioni microbiche o stress nella vite, ma paradossalmente si produce anche per trattamenti chimici come lapplicazione di erbicidi e fungicidi, o per esposizione alla luce UV Nelluva, la sintesi del resveratrolo localizzata prevalentemente nelle cellule della buccia. Nella vinificazione in rosso, quindi, la

macerazione con le bucce fa s che i vini rossi abbiano livelli di resveratrolo maggiori rispetto ai vini bianchi Il contenuto di resveratrolo nel vino dipende soprattutto dalle caratteristiche genetiche del vitigno e dalle condizioni enologiche. Nei vini americani il livello di resveratrolo inferiore a 1 mg/l, mentre nei vini europei la concentrazione maggiore, soprattutto per quelli italiani, francesi e spagnoli. In alcuni casi stato verificato leffetto maggiorativo dellesposizione solare della vite Determinazione del resveratrolo La determinazione quantitativa del resveratrolo nelle sue varie forme (isomeri liberi e glicosilati) si effettua mediante separazione cromatografica con la tecnica HPLC, utilizzando una fase fissa Si-C18 e una fase mobile costituita da un gradiente binario acqua/acetonitrile Lanalisi non si effettua sul campione di vino tal quale, ma su un estratto ottenuto con SPE, facendo passare il campione su una fase adsorbente ed eluendo i composti trattenuti con tetraidrofurano Utilizzando il convenzionale rivelatore UV-visibile a 305 nm si ottiene il cromatogramma

(a), mentre con limpiego del rivelatore a spettrometria di massa (b) si ha un notevole incremento dellatrans-resveratrolo sensibilit. Gli analiti separati sono: 1. glicoside 2. 3. 4. I.S. cis-resveratrolo glicoside trans-resveratrolo cis-resveratrolo standard interno trimetossicinnamico) (acido 3,4,5- Anidride carbonica Lanidride carbonica o biossido di carbonio un gas che si forma come prodotto collaterale durante la gi citata fermentazione alcolica degli zuccheri:

C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 ed ha un ruolo importante nel ciclo di produzione del vino: durante la fermentazione del mosto mantiene infatti un ambiente favorevole impedendo il contatto con l'aria. La sua presenza diventa di importanza decisiva nel caso di vini spumanti e frizzanti nei quali l'anidride carbonica diventa elemento distintivo e qualificante. La sua quantit nel prodotto, espressa come pressione in bottiglia, soggetta a precise norme nazionali e comunitarie Mediante tecniche analitiche come la spettrometria di massa possibile accertare la provenienza della anidride carbonica presente in uno spumante o in un prodotto frizzante e quindi eseguire un accurato controllo di qualit e genuinit Determinazione della CO2 La determinazione dellanidride carbonica si effettua per volumetria. Si porta il campione di vino a temperatura prossima a OC in una soluzione a titolo noto di NaOH (pH 10-11), nella quale la CO2 idratata e convertita ad H2CO3. Si titola leccesso di NaOH con una soluzione acida in presenza di anidrasi carbonica per catalizzare l'idratazione della CO2. Il contenuto in CO2 viene ricavato dal volume di soluzione acida impiegato per passare da pH 8,6 (forma bicarbonato) a pH 4,0 (acido carbonico). Una titolazione di riferimento, effettuata nelle stesse condizioni sul vino privato di CO2, permette di tener conto del volume di soluzione di NaOH consumato dagli acidi Composti aromatici

La qualit di un vino, spesso descrivibile in termini organolettici soggettivi, riconducibile alleffetto che hanno sui nostri organi alcuni composti che influenzano in particolare lodorato e il gusto: i composti aromatici. Prima di capire quali sono questi composti, chiariamo alcuni termini: Si parla di aroma in riferimento al profumo che deriva dalluva, e che pu variare da vitigno a vitigno Si parla di bouquet in riferimento al profumo che deriva dalla vinificazione, comprendendo le condizioni di fermentazione, i vari processi di cantina e linvecchiamento. Il bouquet cambia costantemente man mano che un vino giovane diventa invecchiato (a differenza dellaroma) Determinazione del quadro aromatico La determinazione delle sostanze volatili si effettua ovviamente per gascromatografia, impiegando preferenzialmente

la versione accoppiata con la spettrometria di massa (GC-MS) che permette di identificare strutturalmente le numerosissime e spesso assai complesse sostanze volatili presenti nel vino Per effettuare lanalisi delle componenti volatili, bene effettuare un pretrattamento per isolare soltanto la frazione che li contiene ed evitare di mandare in colonna sostanze non volatili come i composti fenolici o le sostanze inorganiche. Per questo motivo si soliti estrarre la frazione volatile con unestrazione liquido-liquido o con metodi SPE Estrazione in fase solida del vino Nellestrazione in fase solida (SPE) il campione di vino fatto fluire attraverso una colonna contenente materiale sorbente, in grado di trattenere selettivamente alcune classi di sostanze, le quali sono poi desorbite con un opportuno solvente. Il solvente pu essere iniettato in colonna con maggiore facilit in quanto avr un contenuto di sostanze disciolte nettamente inferiore rispetto al campione originario Attivazione del materiale sorbente Passaggio del campione sulla colonnina con

trattenimento selettivo degli analiti Lavaggio per eliminare specie indesiderate Desorbimento (eluizione) degli analiti trattenuti con un opportuno solvente Microestrazione in fase solida del vino Nella microestrazione in fase solida (SPME) una fibra ricoperta di materiale sorbente immersa nel campione di vino oppure nello spazio di testa in recipiente chiuso (1); le sostanze che hanno affinit per la fase sorbente vengono estratte (2) e possono essere rilasciate per riscaldamento della fibra (3), cosa che pu avvenire nelliniettore di un gascromatografo (4). In questa tecnica, il carico di sostanze disciolte nella colonna del tutto irrilevante, in particolare nella versione che agisce sullo spazio di testa 15.0e6 12.5e6 10.0e6

7500e3 5000e3 2500e3 5 1 2 3 10 15 20 25 30 35 4 40

45 50 55 60 65 Esempio di analisi GC-MS Quale che sia il tipo di pretrattamento, lanalisi GC-MS dei composti volatili permette di determinare un numero elevato di sostanze, quindi di caratterizzare ampio il quadro aromatico. In un vino sono determinabili 50-100 sostanze aventi caratteristiche di volatilit, in prevalenza alcoli, terpeni ed esteri. Con opportuni trattamenti, possibile ampliare gruppo di composti, il con la possibilit di caratterizzare le variet Nella figura riportato un esempio di analisi GC-MS di un estratto SPME da vino Nebbiolo Composti volatili I composti volatili presenti nel vino sono responsabili del suo

profumo. Essi hanno tendenza ad evaporare e chimicamente appartengono, tra le altre, alle famiglie dei terpeni, alcoli, aldeidi, chetoni, acidi ed esteri. Sono stati identificati circa 500 composti diversi che influenzano il profumo del vino; di questi, soltanto un centinaio stato quantificato I composti volatili sono suddivisibili in tre classi, a seconda della loro origine: primari, detti anche varietali perch caratteristici da Composti variet a variet di Vitis vinifera; tipici composti varietali sono ad esempio i terpeni Composti secondari, che si sprigionano durante i processi di vinificazione, in particolare al momento della pigiatura (prefermentativi) e durante le fermentazioni (fermentativi) Composti terziari, che si generano durante la maturazione e linvecchiamento, in relazione anche alle condizioni di conservazione che possono essere ossidanti (a contatto con laria) o riducenti (in assenza di aria) Profumi primari Sono i composti varietali, presenti nelluva e caratterizzanti da vitigno a vitigno. La maggior parte dei composti aromatici varietali sono i terpeni, sostanze di varia natura chimica (alcoli, aldeidi, idrocarburi, chetoni, ecc.) ma riconducibili allunit di base

isoprenica Alcuni esempi di terpeni sono geraniolo, nerolo, citronellolo e linalolo ossido Nel vino i terpeni, pur avendo un impatto sensoriale elevato, hanno concentrazione molto basse, dellordine dei g/l.la GC-MS inSoltanto una tecnica come grado di riconoscerli e determinarli quantitativamente nerolo citronellol o geraniol o linalolo ossido A Profumi secondari I profumi secondari, prefermentativi e postfermentativi, sono in massima parte esteri. Nel vino sono stati identificati circa 300 esteri, molti dei quali danno al vino le classiche note fruttate.

Lorigine degli esteri in parte dalla fermentazione ( esteri neutrali o volatili), in parte da processi di invecchiamento che coinvolgono reazioni lente di esterificazione (esteri acidi o nonvolatili) Tra gli esteri del vino ci sono ovviamente molti esteri etilici, derivanti dalletanolo, ed esteri metilici, derivanti dal metanolo Profumi terziari Sono i composti che vengono rilasciati o si formano nel corso dellinvecchiamento. Essi dipendono strettamente dalle condizioni di maturazione e dal tipo di recipiente. Ad esempio, nella conservazione in barrique si generano nel vino sostanze estremamente caratteristiche derivanti dal legno e suddivisibili in quattro classi: Furani, come il 5.6-diidro-4-metil2H-piran-2-one, che impartisce al vino un aroma di zucchero filato Vanillina Lattoni, come il 3-metil-ottanolattone, responsabile dellaroma di noce di cocco Aldeidi fenoliche, come la vanillina o 4-idrossi-3-metossibenzaldeide, che impartisce il tipico aroma di

4vaniglia vinilguaiacolo Fenoli, come il 4-vinilguaiacolo, responsabile della nota di bruciato Alcuni di questi composti sono rilasciati dal legno, altri invece si formano nelle condizioni ossidanti o riducenti, a partire da composti Nota di kerosene La nota di kerosene o asfalto si forma in vini bianchi invecchiati in botti. I composti responsabili di questo particolarissimo carattere sono due norisoprenoidi, il vitispirano e l1,1,6-trimetil-1,2diidronaftalene o TDN, derivati dai carotenoidi presenti nelluva. Questi composti hanno una soglia olfattiva di 0.8 mg/l e 0.02 mg/l rispettivamente. Bench la nota di asfalto sia considerata spesso unimperfezione nei vini bianchi, essa caratteristica dei Riesling invecchiati La determinazione di questi composti non

semplice, essendo presenti a concentrazioni molto basse. Normalmente necessario uno stadio di estrazione per isolare gli analiti dalla matrice, a cui segue lanalisi gascromatografica H3C CH 3 O CH3 CH2 vitispirano H3C CH3 CH3 TDN Pirazine Le pirazine sono composti aromatici molto potenti che si trovano frequentemente in natura in prodotti come i piselli e i peperoni verdi. Ci sono tre

tipi di pirazine: la isopropilmetossipirazina, prevalente in asparagi e piselli, la isobutilmetossipirazina, prevalente nei peperoni verdi, e la sec-butilmetossipirazina che si trova prevalentemente nelle barbatietole Queste sostanze sono state recentemente individuate anche in alcuni vini (Sauvignon bianco, Merlot nero, Cabernet sauvignon) ai quali conferiscono una nota erbacea o, appunto, di peperone verde in virt della loro soglia olfattiva estremamente bassa: 1-2 ng/L nei vini bianchi e 1015 ng/L nei rossi, ovvero lequivalente di un grappolo su 500.000 tonnellate. Sono quindi sostanze di grande interesse dal punto di vista aromatico; peraltro i consumatori ne gradiscono il contributo nei vini bianchi ma non nei rossi CH3 N CHCH3 N OCH3

CH3 N CH2CHCH3 N OCH3 CH2CH3 N CH CH3 N OCH3 Determinazione delle pirazine La determinazione delle pirazine complessa a causa della concentrazione, generalmente molto bassa, e della difficolt di

individuarle in mezzo a centinaia di altre sostanze volatili. Soltanto una tecnica potente come la GC-MS in grado di identificarle e dosarle Nelle figure sono riportati i cromatogrammi ottenuti con SPME-GC-MS in un Merlot nero (alto) e in un Cabernet Sauvignon (sx). Le pirazine identificate sono presenti a livello di pochi ng/l, concentrazioni comunque gi attive dal punto di vista organolettico Sostanze inorganiche Le sostanze inorganiche nel vino hanno scarsa importanza dal punto di vista qualitativo, tranne influenzare negativamente i caratteri organolettici se presenti in quantit eccessive, es. il sodio

in eccesso pu dare una nota salata sgradevole Dal punto di vista analitico possiamo classificare i composti inorganici in tre categorie: cationi, cio ioni positivi di metalli, presenti come controioni di composti organici carichi negativamente, come gli acidi carbossilici, oppure come impurezze anioni, cio ioni negativi, solitamente provenienti dalladdizione di composti impiegati nel processo di vinificazione ceneri, linsieme delle sostanze inorganiche rimaste dopo lincenerimento dellestratto secco Ceneri Con il termine ceneri si intende l'insieme dei prodotti ottenuti per incenerimento del residuo dell'evaporazione del vino (il gi citato estratto secco), trattamento condotto in modo da ottenere la totalit dei cationi (ad esclusione dello ione ammonio) sotto forma di carbonati, di ossidi o di altri sali minerali anidri. Lincenerimento dell'estratto del vino effettuato fra 500 e 550C fino a combustione completa dei composti di carbonio. A quelle temperature tutta la materia organica decomposta a CO 2, H2O e sottoprodotti di degradazione termica La determinazione delle ceneri si effettua in modo semplice, dosando un volume noto di vino su crogiolo di platino tarato e ponendo il crogiolo prima su piastra riscaldante a 200C per portare a secco il campione, poi in forno elettrico a 525C. Il peso finale, detratto della tara del crogiolo, fornisce il dato delle ceneri Le ceneri hanno carattere alcalino, essendo composte prevalentemente da ossidi e carbonati. L'alcalinit delle ceneri un altro parametro che si misura

ed equivale alla somma dei cationi, diversi dall'ammonio, combinati agli acidi organici del vino. La determinazione si effettua per titolazione con NaOH delleccesso di acido solforico necessario per solubilizzare a caldo le ceneri, in presenza di indicatore metilarancio Cationi inorganici I cationi hanno funzioni varie nelluva; nel vino non hanno invece un ruolo di primaria importanza. Si originano nel vino a seguito di assunzione di sostanze minerali da parte della vite, oppure per addizione di composti aventi funzioni varie alluva, al mosto e al vino grezzo. Possiamo distinguere i cationi in tre gruppi: elementi derivanti dal contributo minerale del terreno e dalla capacit della vite di assumere sostanze minerali (Al, B, Ba, Li, Mn, Mo, Rb, Si, Sr e Ti o elementi in tracce e ultratracce) elementi la cui origine in parte naturali, in parte artificiale (Ca e Mg, Cu e Zn, Fe, K e Na, P) elementi di origine quasi esclusivamente artificiale (Pb, Cd, Co, Cr, Ni) La determinazione dei cationi ha importanza soprattutto dal punto di vista sanitario e qualitativo, in quanto molti di questi elementi in concentrazioni eccessive sono dannosi per la salute o comunque per la qualit del vino. Non a caso nel processo di vinificazione si effettua il passaggio di affinamento noto come demetallazione, che provoca un abbassamento generale del contenuto di metalli mediante precipitazione Determinazione di cationi

Per la determinazione dei cationi, le normative ufficiali prevedono metodi di analisi singoli per alcuni elementi, cosa che peraltro rende i tempi di analisi inutilmente lunghi. Le tecniche richieste sono: Fotometria di fiamma per K e Na Spettrofotometria di assorbimento atomico con fiamma per Mg, Ca, Fe, Cu, Ag e Zn Spettrofotometria di assorbimento atomico con fornetto di grafite per Cd Pb Dalepunto di vista pratico ed economico molto pi vantaggioso limpiego di tecniche multielementari, cosa che, tra laltro, permette di determinare un numero maggiore di elementi oltre a quelli espressamente richiesti dalle normative. Le tecniche pi idonee sono le seguenti: Cromatografia a scambio cationico, per ioni alcalini e alcalino-terrosi e metalli di transizione Voltammetria di stripping anodico per metalli di transizione Spettrometria di emissione atomica con plasma induttivamente accoppiato per tutti gli elementi Spettrometria di massa con plasma induttivamente accoppiato per tutti

gli elementi Determinazione di cationi con IC La cromatografia ionica permette di separare e quantificare ioni in soluzione. Nellanalisi del vino impiegata per determinare cationi alcalini (Li+, Na+, K+, Rb+), alcalino-terrosi (Mg2+, Ca2+, Sr2+, Ba2+) e ione ammonio (NH4+). La determinazione si effettua con rivelazione conducimetrica sul campione diluito 1:50 e con eluente acido Determinazione di metalli con IC Per la determinazione di metalli di transizione (Fe2+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+) e metalli pesanti (Pb2+, Cd2+) necessario un altro tipo di rivelatore; normalmente si utilizza una reazione di derivatizzazione post-colonna con un legante e rivelazione spettrofotometrica a 530 nm La separazione preceduta da un trattamento del campione con raggi UV, in modo da distruggere i composti organici presenti nel vino che interferirebbero pesantemente con la

separazione cromatografica agendo da complessanti 1. Pb2+ 2. Cu2+ 3. Zn2+ 4. Ni2+ Determinazione di metalli con ICP Tra le tecniche spettroscopiche per la determinazione degli elementi nel vino, particolarmente utili sono la spettrometria di massa con plasma induttivamente accoppiato (ICP-MS) e la spettrometria di emissione atomica con plasma induttivamente accoppiato (ICP-AES), tecniche che presentano limiti di rivelabilit dellordine di ng/l (la prima) e g/l (la seconda) e quindi sono idonee per lanalisi del vino in cui molti elementi sono presenti in tracce o ultratracce, soprattutto quelli significativi dal punto di vista sanitario (Cd, Hg, Pb). Le due tecniche presentano il grosso vantaggio di poter determinare sequenzialmente un numero elevatissimo di elementi Schema di funzionamento Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometer Plasma Monocromatore Detector

Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer Plasma Detector Analizzatore a quadrupolo Esempio di strumento ICPAES Smaltimento Sistema Torcia di ottico quarzo in posizione assiale 2 canali: Nebulizzatore 1 per il CameraPompa di campione 1nebulizzazione per lo scarico peristaltica al PC fumi Esempio di strumento ICPMS

Smaltimento Spettrometro Interfaccia di massa Torcia di quarzo Nebulizzatore Pompa Camera di peristaltica nebulizzazione fumi al PC Limiti di rivelabilit I limiti di rivelabilit per la tecnica ICP-MS sono molto pi bassi rispetto allICP-AES e alle altre tecniche di spettroscopia atomica Anioni inorganici Gli anioni inorganici presenti nel vino sono principalmente fosfato, importante nella

fermentazione del mosto, e solfato, dallossidazione dellanidride solforosa; sono inoltre presenti borato, silicato e cloruro. Un eccesso di cloruro di sodio pu dare una nota salata fastidiosa anionico con eluente La determinazione degli anioni si effettua per cromatografia a carbonato/bicarbonato scambio oppure con eluente NaOH; la rivelazione conducimetrica Nella figura riportato il cromatogramma ottenuto dellanalisi di un campione di vino rosso diluito 1:10; gli anioni sono separati insieme agli acidi carbossilici Composti indesiderati

Nel vino sono a volte presenti sostanze che si formano in condizioni particolari e che danno al vino note organolettiche negative. Alcuni esempi di composti indesiderati sono i seguenti: 2,4,6-tricloroanisolo (TCA): il composto OCH3 OH responsabile del famoso gusto di tappo, Cl Cl Cl Cl avente una soglia olfattiva di ~5 ng/l; si forma nei tappi di sughero a seguito del Cl trattamento di sbiancamento con Cl Cl ipoclorito, come il suo analogo 2,3,4,6tetraclorofenolo CH2 CH3 CH 2 etilfenoli (4-etilfenolo e 4-etilguaiacolo) e HC vinilfenoli (4-vinifenolo e 4-vinilguaiacolo) si originano dagli acidi cinnamici transOCH3 ferulico e

trans-p-cumarico, con il OH OH contributo di lieviti del genere Brettanomyces; questi composti sono responsabili delle note fenoliche e medicinali dei vini deteriorati Determinazione di 2,4,6TCA La determinazione del 2,4,6-tricloroanisolo nel vino si pu effettuare per GC, impiegando la tecnica SPME o altre tecniche di estrazione Nella figura, lanalisi effettuata per GC-MS dopo trattamento SPME con una fibra di polidimetilsilossano, un materiale sorbente avente affinit per i composti organici

volatili. Nel cromatogramma A riportata lanalisi di un campione di vino addizionato con 40 ng/l di TCA (picco 1) e 50 ng/l di triclorotoluene (picco 2, standard interno); il TCA non sembra presente nel campione tal quale (cromatogramma B) Determinazione di etil- e vinilfenoli Essendo composti volatili, gli etil- e vinilfenoli si determinano per gascromatografia. Lanalisi non effettuata sul vino tal quale, bens su un estratto ottenuto per SPE, passando il campione su una colonnina di polistirene-divinilbenzene ed eluendo i composti polari trattenuti con diclorometano Nella figura riportato il cromatogramma di un estratto di fenoli volatili da un campione di vino

Sherry variet Fino, contaminato da lieviti del genere Brettanomyces. I (1) 4-etilguaiacolo composti rivelati (2) 4-etilfenolo sono: (3) 4-vinilguaiacolo (4) 4-vinifenolo Anidride solforosa Lanidride solforosa (SO2) un composto di grande importanza in enologia, in quanto, pur essendo utilizzata principalmente come antisettico, svolge anche altre funzioni: asseconda lestrazione delle sostanze coloranti, protegge il mosto dallossidazione e, in generale, permette di ottenere vini pi sani e serbevoli (cio le cui caratteristiche possono conservarsi senza deterioramento per un certo periodo di tempo). Inoltre, forma composti di reazione con sostanze presenti nel vino, che in alcuni casi hanno influenza diretta sul gusto e sullaroma; per questo si soliti distinguere la percentuale di SO2 libera e combinata. Composti che reagiscono facilmente sono gli antociani, lacetaldeide e gli zuccheri In realt, attualmente limpiego della SO2 tendenzialmente limitato alladdizione in fase di svinatura e imbottigliamento; inoltre esistono precisi limiti di legge (160 mg/l per i vini rossi e 200 mg/l

per i bianchi e i rosati) dovuti al fatto che si tratta di una sostanza che pu dare disturbi intestinali o il famoso cerchio alla testa Determinazione della SO2 La determinazione della SO2 si effettua per volumetria, utilizzando una titolazione acido-base oppure una titolazione redox Nel primo metodo, mediante una corrente di aria o di azoto la SO 2 viene fissata e ossidata per gorgogliamento in una soluzione diluita neutra di H2O2: SO2 + H2O2 SO3- + H2O H2SO4 L'acido solforico formato viene dosato con una soluzione a titolo noto di NaOH. Questo metodo determina la SO2 totale; la frazione libera viene estratta dal vino per trascinamento a freddo (10C) Nel secondo metodo la SO2 libera dosata con titolazione iodometrica diretta: H2SO3 + I2 H2SO4 + 2HI Si dosa quindi la SO2 combinata dopo idrolisi alcalina e la SO2 totale per somma delle due frazioni Adulterazione del vino Il vino, tra gli alimenti, uno dei prodotti maggiormente sottoposto a frode. Vini di alta qualit o di annate particolari raggiungono prezzi elevati, diventando lobiettivo ideale di pratiche illecite. Nonostante la legislazione sul vino sia una tra le pi complete e il vino sia tra gli alimenti maggiormente analizzati, lentit delle frodi talmente elevata da essere difficilmente quantificabile Le frodi sul vino causano un grande danno di immagine al mercato in termini di fiducia del consumatore, soprattutto nel contesto attuale in cui i prodotti dei Paesi emergenti in campo enologico (Argentina, Australia, Cile, California, Nuova Zelanda) diventano

competitivi Fino a poco tempo fa, lunico modo per verificare lautenticit di un vino consisteva nellassaggio da parte di esperti. Attualmente, sono stati sviluppati metodi che accoppiano strumenti matematici e tecniche analitiche avanzate, permettendo cos lapplicazione a studi di autenticazione e tracciabilit. Il ruolo della chimica analitica quindi evidente e giustificato dal valore del prodotto Principali frodi Le principali frodi in campo enologico sono: Diluizione con acqua (annacquamento) Vini ottenuti dalla fermentazione di zuccheri di natura diversa da quelli dell'uva (pratica vietata in Italia, ma consentita in altri Paesi) Aggiunta di sostanze non consentite: alcool, antifermentativi, aromatizzanti, coloranti Messa in commercio di vini di qualit differente da quella dichiarata in etichetta Messa in commercio di vini non conformi alle norme acescenti (con acido acetico > 1 g/l) con contenuto di anidride solforosa eccessivo con gradazione alcolica inferiore a quella prevista vinificato da vitigni non permessi dal disciplinare Metodi per riconoscere le frodi Le tecniche maggiormente utilizzate per riconoscere le frodi e le adulterazioni sono le seguenti, in ordine di importanza: Analisi degli isotopi stabili nella versione Isotope Ratio Mass Spectrometry (IRMS), tecnica che sfrutta la spettrometria di

massa per evidenziare le distribuzioni isotopiche caratteristiche di materiali aventi origine diversa; in particolare sono utilizzati gli isotopi di C, H, O, N, Sr e Pb Risonanza Magnetica Nucleare (NMR): si tratta di una tecnica potentissima per la differenziazione di prodotti alimentari di origine diversa o ottenute con procedimenti diversi Spettrometria di massa con plasma induttivamente accoppiato (ICP-MS): si tratta di una tecnica elementare, in grado di determinare quasi tutti gli elementi del sistema periodico in concentrazioni estremamente basse Cromatografia: il termine riassume un insieme di tecniche di separazione, alcune delle quali sono impiegate per la determinazione di classi di composti che possono essere utilizzati nella differenziazione di prodotti alimentari Addizione illecita di coloranti Attraverso la determinazione del profilo antocianico spesso possibile riconoscere laddizione illecita di sostanze coloranti, impiegata per impartire al vino un colore pi attraente Gli antociani sono presenti in molti frutti a bacca colorata (ribes, mirtillo, ciliegia, fragola, uva); estratti antocianici sono impiegati nellindustria alimentare come coloranti naturali, ma il loro impiego nel vino ovviamente vietato

Il riconoscimento si basa sul fatto che nelluva sono presenti 5 antocianine di base (cianidina, delfinidina, malvidina, peonidina e petunidina) aventi soltanto residui di glucosio. Lidentificazione di antocianine con altri residui zuccherini indica limpiego di estratti di frutti diversi, come nel caso riportato dove si identifica laddizione di estratto di bacca di sambuco (elderberry in inglese), che contiene cianidina con un residuo di sambubioside, uno zucchero caratteristico del sambuco Tecniche isotopiche Le tecniche isotopiche sono state sviluppate allinizio degli anni 80 in Francia (Universit di Nantes) e hanno avuto grande applicazione in tutti i campi della ricerca scientifica. Attualmente sono in grande espansione grazie allintroduzione di strumentazioni molto sofisticate Isotopo ( + ) = stesso posto La quantificazione del rapporto da due isotopi dello stesso elemento ha potenzialit notevoli nello stabilire se due oggetti chimicamente simili hanno provenienza diversa, in relazione alla differenza delle materie prime. Fenomeni di vario tipo influenzano la distribuzione isotopica degli elementi nelle materie prime, determinando differenze nei prodotti finali che possono essere rivelate dalle

tecniche di analisi isotopica Applicazioni in campo alimentare Lanalisi degli isotopi stabili molto importante soprattutto negli studi di autenticit degli alimenti e quindi del vino. Essa, sulla base dei differenti rapporto isotopici, permette di riconoscere molecole, presenti in alimenti, aventi la stessa struttura chimica ma provenienti da materie prime diverse o elaborate con processi diversi, per esempio per sintesi biologica o industriale Si possono distinguere: gli aromi naturali (es. vanillina) da quelli di sintesi lacido acetico proveniente dalla fermentazione acetica da quello ottenuto industrialmente i salmoni selvatici da quelli di allevamento (in base ad un lipide caratteristico) laggiunta di zuccheri diversi da quelli presenti naturalmente lannacquamento del latte la provenienza geografica di alimenti Applicazioni in campo alimentare Discriminazione di prodotti di differente origine biosintetica e geografica

Applicazioni gi regolamentate per vino, aceti, succhi di frutta e miele Controllo di frodi alimentari Studi per nuove applicazioni in olio, vanillina, caffeina, vegetali, carne, latte e formaggio Controllo della composizione Tipicizzazione di alimenti di origine controllata (es.DOP, IGP, della dieta animale certificazioni di tipo biologico) Aggiunta di zucchero esogeno Grado di utilizzo di mangime nellalimentazione Annacquamento Lanalisi isotopica in enologia La ricerca di sofisticazioni in enologia si pu effettuare con le tecniche isotopiche: sofisticazione del vino per aggiunta di zuccheri diversi da quelli presenti nelluva (bietola, canna, mais), una pratica illecita in Italia

annacquamento del vino Inoltre si pu stabilire con discreta approssimazione la zona di provenienza di un vino Per chiarire limportanza dellintroduzione di queste tecniche va considerato che prima del loro avvento, i metodi esistenti per scoprire le sofisticazioni erano abbastanza inefficaci. Laddizione di saccarosio ai mosti genera rapidamente per idrolisi fruttosio e glucosio, zuccheri gi presenti nelluva e quindi indistinguibili: CH2OH H HO O H OH H H OH H HOCH2 O H O H OH

HOCH2 HO H CH2OH H CH2OH O H OH OH HO H CH2OH H + HO

O H OH H H OH H OH Le molecole di fruttosio e glucosio introdotte fraudolentemente hanno per una traccia della loro origine, nascosta nella distribuzione isotopica degli elementi che li costituiscono (carbonio, idrogeno e ossigeno). Questa distribuzione diversa a seconda dellorigine del saccarosio o del trattamento cui stato sottoposto Gli isotopi Isotopi di uno stesso elemento hanno uguale numero di protoni (e quindi di elettroni) ma diverso numero di neutroni hanno lo stesso numero atomico (Z) ma un diverso numero di massa (A) massa differente Gli isotopi di uno stesso elemento hanno quindi propriet chimiche simili, in ragione dello stesso numero di protoni, ma propriet fisiche diverse, in ragione della massa differente. Tutti gli elementi

(tranne 12) esistono in almeno due forme isotopiche Esempio: lidrogeno Idrogeno 1 elettrone (rosso) 1 protone (verde) Tritio 1 elettrone (rosso) 1 protone (verde) 2 neutrone (blu) Deuterio 1 elettrone (rosso) 1 protone (verde) 1 neutrone (blu) Il Tritio artificiale e quindi non di interesse in questa tecnica che si basa sui soli isotopi stabili Distribuzioni isotopiche La distribuzione isotopica stabile (non considerando, cio, gli isotopi artificiali) degli elementi dipende strettamente dall origine e dallevoluzione biogeochimica dei composti di cui fanno parte. Quindi due composti aventi la

stessa formula, es. il biossido di carbonio CO2, possono avere differente composizione isotopica se la loro origine e/o la loro storia sono diverse Le proporzioni degli isotopi stabili nei vari composti sono approssimativamente quelle medie esistenti sulla terra, tuttavia le piccole deviazioni dalla media sono la chiave per differenziare un campione dallaltro Nellelenco seguente sono indicate le distribuzioni medie di alcuni elementi; le 1H: cifre indicate 2Hino D: rosso sono 99.984% 0.015 57% quelle che contengono linformazione discriminante 13 12 C: 98.89 % C: 1.11140% 15

14 N: 99.64% N: 0.36630% 17 18 16 O: 99.76% O: 0.04% O: 0.20004% 33 34 36 32 S:95.02% S: 0.75% S: 4.21500% S:0.02% Per poter mettere in risalto le differenze tra le distribuzioni isotopiche di un elemento in due campioni diversi necessaria una tecnica in grado di misurare masse atomiche e molecolari con grandissima accuratezza e Espressione dei risultati I rapporti isotopici sono usualmente espressi in termini di valori che esprimono le deviazioni, in parti per mille, da un materiale di riferimento: Rcampione X 1 x 1000 Rstandard

o lespressione equivalente: Rcampione Rstandard x 1000 X Rstandard dove R = rapporto massa isotopo pesante/massa isotopo leggero (es. 18 O/16O) X > 0 indica un arricchimento dellisotopo pesante nel campione rispetto allo standard X < 0 indica un impoverimento dellisotopo pesante o un arricchimento dellisotopo leggero rispetto allo standard Standard di riferimento Element o Isotopi stabili Abbondanza naturale media (%) H

99.985 H 0.015 C 98.892 C 1.108 N 99.6337 N 0.3663 O 99.7587 O 0.2039

S 95.02 S 4.22 1 Idrogeno 2 12 Carbonio 13 14 Azoto 15 16 Ossigeno 18

32 Zolfo 34 Valori dei rapporti standard H/1H = 2 0.000316 C/12C = 13 0.0112372 N/14N = Standard di riferimento internazionale V-SMOW (Vienna Standard Mean Ocean Water) V-PDB (Vienna-Pee Dee Belemnite) Carbonato di calcio fossile 15

0.007353 O/16O = 18 0.0039948 S/32S = 34 0.0450045 AIR (Azoto dellaria) V-SMOW (Vienna Standard Mean Ocean Water) V-CDT (Canyon Diablo Troilite) N.B. la distribuzione isotopica nei materiali standard di riferimento differente da quella naturale media! Frazionamento isotopico La possibilit di differenziare due campioni in base allanalisi isotopica legata al fenomeno di frazionamento isotopico che avviene nelle materie prime, ovvero nella deviazione dalla distribuzione isotopica naturale degli elementi in conseguenza a fenomeni biogeochimici naturali o artificiali Si noti che le variazioni sono misurate rispetto ad un materiale standard con distribuzione diversa da quella naturale

La variazione naturale di abbondanza isotopica conseguenza delle diverse propriet chimico-fisiche degli isotopi di uno stesso elemento Massa differente EFFETTO CINETICO EFFETTO TERMODINAMICO Differente velocit di reazione Differente energia libera Frazionamento nellacqua Per valutare le cause e levoluzione del frazionamento in relazione al ciclo produttivo del vino, consideriamo gli elementi di maggior interesse nei processi biosintetici: idrogeno, carbonio e ossigeno. Questi elementi formano due molecole fondamentali nella vita delle piante: acqua e anidride carbonica H, C, O H2O, CO2 Lacqua tende per natura ad evaporare con una reazione di equilibrio regolata dalla temperatura: H218O(g) + H216O(l) H216O(g) + H218O(l) Allequilibrio, lacqua in fase vapore si arricchita in 16O (18O < 0)

essendo le molecole di 1H16O pi leggere e quindi pi propense allevaporazione. Per lo stesso motivo, la fase liquida sar pi ricca in 2H16O, 1H18O e 2H18O, molecole pi pesanti (18O e 2H > 0) Ciclo dellacqua Durante i fenomeni di evaporazione e precipitazione si verifica frazionamento isotopico dellossigeno Lentit del frazionamento dipende dalla temperatura, la quantit di umidit rimossa, il tipo di condensazione (conversione in acqua o in ghiaccio) e altri fattori climatici e geografici Effetto della temperatura Essendo il frazionamento dipendente dalla temperatura, dal punto di vista geografico il valore di 18O diminuisce: allaumentare della latitudine allaumentare dellaltitudine Frazionamento nei vegetali Nel ciclo vegetativo delle

piante, lassorbimento di acqua dal terreno e il processo di traspirazione, caratteristico di ciascuna specie, causano anchessi un arricchimento di isotopi 18 pesanti (2H e O), in dipendenza dalla specie vegetale e dalle condizioni climatiche (climi freddi, piovosi o caldo-aridi) Quindi, in dipendenza di questi parametri, le piante hanno a disposizione acqua "isotopicamente" diversa, da

utilizzare nella fotosintesi Esempi di frazionamento 18 O/16O Ciclo della CO2 L'anidride carbonica, essendo allo stato gassoso, subisce il processo di frazionamento per transizione di fase in modo molto meno sensibile, anche se dai dati acquisiti nel corso degli anni si potuto osservare che un lieve frazionamento dovuto alla latitudine, probabilmente per fattori climatici quali la temperatura Nella tabella sono riportati i valori dei rapporti isotopici di idrogeno, carbonio e ossigeno misurati in vini provenienti dalle regioni italiane per lannata 1994 13 D/H e C/12C

misurati nelletanolo 18O/16O misurato nellacqua Regioni D/ H ppm A br uzzo 102.93 Basilicat a 103.92 Calabr ia 103.22 Campania 102.40 Emilia- Romagna 101.18 F r iuli- V.G. 101.74 Lazio 103.09 Ligur ia 101.01 Lombar dia 100.19 Mar che 101.52 Molise 102.69 Piemont e 99.96 Puglia

103.47 S ar degna 103.27 S icilia 104.21 T r ent ino A .A . 100.88 T oscana 101.74 Umbr ia 101.78 Venet o 101.81 C - 24.93 - 25.39 - 26.61 - 26.37 - 26.89 - 25.81 - 25.77 - 26.04 - 26.50 - 26.42 - 26.12 - 26.52 - 24.87 - 25.51 - 25.32

- 26.96 - 25.91 - 26.79 - 26.06 O 5.14 5.43 6.67 3.34 1.72 1.43 4.80 2.02 1.12 2.61 5.30 0.72 6.75 6.34 7.54 0.52 4.15 3.65 1.00 Frazionamento biosintetico Il ciclo della fotosintesi con la produzione di glucosio determina ancora una modifica isotopica per quanto riguarda il contenuto in deuterio dell'acqua, ma diventa estremamente selettivo per quanto

riguarda l'anidride carbonica e quindi il rapporto isotopico 13C/12C. Il cammino fotosintetico per la fissazione della CO 2 ne infatti la principale fonte di variazione. Le piante incorporano CO 2 secondo tre meccanismi biosintetici: il ciclo di Calvin o C3 (es. vite e barbabietola) il ciclo di Hatch-Slack o C4 (es. canna e mais) il ciclo noto come Crassulean Acid Methabolism o CAM, meno comune Il meccanismo C3 provoca un frazionamento del carbonio molto pi elevato rispetto agli altri due meccanismi. Gli isotopi pi pesanti, in questo caso il 13C, sono cineticamente meno favoriti e quindi pi lenti a reagire, per cui, maggiore il numero dei passaggi di reazione e tanto pi sar selettivo il processo Frazionamento di 12C e 13C Al termine del ciclo Al termine del ciclo sintetico si producono molecole di glucosio che hanno un contenuto isotopico correlato a quello dell'acqua e dell'anidride carbonica impiegate, nonch del ciclo fotosintetico seguito La successiva fermentazione

alcolica che trasforma il glucosio ad alcol etilico modifica solo in parte i rapporti isotopici (maggiormente per D/H), per cui essi si ritrovano nelle molecole di alcol etilico prodotte Parametri D/H nei vegetali PARAMETRI CHE INFLUENZANO IL RAPPORTO D/H NEI COMPOSTI VEGETALI Composizione isotopica dell'acqua di falda effetto geografico - continentale condensazione condensazione ciclo planetario dell'acqua Evapotraspirazione fogliare Provenienza vegetale dellalcol effetto latitudine

effetto altitudine effetto climatico (temperatura - umidit relativa) piante a ciclo C3 ( 96 108 ppm ) piante a ciclo C4 (canna da zucchero, mais) (110-115 ppm) bietola, fragola (91-93 ppm) mele, pere, ciliegie ( 95 101 ppm ) vite ( 98 108 ppm ) Esempi di frazionamento 2D/1H Informazioni fornite dai r.i. In definitiva, i fenomeni naturali che si succedono durante il ciclo degli elementi C, H e O sono tali da permettere una differenziazione del prodotto finale. In base al tipo di rapporto isotopico in considerazione, si possono avere le informazioni descritte nella tabella Rapporto isotopico I nf luenzato da Pu determinare A ggiunt a illecit a di

M e t a b o l i s m o 13 zuccher o di canna C/ 12C, D/ H (C3, C4, CA M) e/ o bar babiet ola Or igine 18 A nnacquament o O/ 16O, D/ H dellacqua A ggiunt a di 13 12 S i n t e

s i c h i m i c a C/ C , D/ H sost anze di sint esi Car at t er izzazione 18 O/ 16O, D/ H, Or igine di pr odot t i ad 15 geogr af ica or igine pr ot et t a e N / 14N , 13C/ 12C cont r ollat a Antisofisticazioni La contraffazione dovuta alladdizione di zuccheri di canna o bietola relativamente semplice da identificare, in base al rapporto isotopico D/H. Il valore dovuto allo zucchero presente naturalmente nel vino 98-102 ppm; valori superiori indicano addizione di zucchero di canna e mais, mentre valori inferiori indicano addizione

di zucchero di bietola. La misura effettuata normalmente con la tecnica di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) L'aggiunta di una miscela equivalente di zuccheri di canna e bietola non modifica il rapporto isotopico del deuterio, ma comunque evidenziabile dall'aumentare del rapporto isotopico 13C/12C Lannacquamento del vino rivelabile in base al rapporto 18O/16O: infatti lacqua esterna ha un contenuto in 18O minore dell'acqua del vino e far diminuire di conseguenza il valore del rapporto isotopico misurato. La misura effettuata normalmente con una tecnica di Spettrometria di Massa Metodi ufficiali di analisi Le potenzialit dellanalisi isotopica sono tali che nel corso degli ultimi anni alcuni metodi di analisi sono diventati ufficiali al livello nazionale ed europeo Il Regolamento CEE 2676/90 (determinazione dei metodi comunitari di analisi da utilizzare nel settore del vino) prevede la rivelazione dellaumento del titolo alcolimetrico di mosti e vini, ottenuto con addizione fraudolenta di saccarosio, mediante analisi NMR del rapporto D/H Il Regolamento CEE 822/97 (modifica del Regolamento precedente) prevede la determinazione del rapporto isotopico 18O/ 16 O dellacqua contenuta nei vini per identificare il possibile

fraudolento annacquamento di un vino Il Regolamento CE 440/2003 (modifica del Regolamento precedente) prevede la determinazione del rapporto isotopico 13C/ 12 C delletanolo nei vini e nei mosti mediante tecnica IRMS per identificare laddizione fraudolenta di miscele di saccarosio da bietola e canna Banche Dati Va considerato che la variazione dei rapporti isotopici dell'alcol di vino pu essere oscillante. Ad esempio per il rapporto D/H nei vini italiani, a seconda della latitudine, del clima e della piovosit si possono avere valori compresi tra circa 98 e 107 ppm Per avere un campione statistico rappresentativo di tutta la produzione viticola italiana necessario effettuare un'indagine su tutto il territorio nazionale. A questo scopo sono state costituite, a partire dal 1987, col patrocinio del Ministero delle Politiche Agricole e Forestali - Ispettorato Centrale per la Repressione delle Frodi, le Banche Dati su campioni di vino sicuramente genuini e provenienti da tutta Italia. Ogni anno vengono raccolti circa 500 campioni di uva da tutte le regioni italiane e per ogni prelievo viene compilata una scheda con le principali informazioni del vigneto; dati relativi alla produzione (kg per ceppo, resa per ettaro) eventuale irrigazione, piovosit. Tali uve vengono successivamente vinificate in laboratorio, ottenendo il vino da analizzare Nel caso del Rapporto isotopico del deuterio, la Banca Dati Italiana stata formalmente validata da una Commissione della Comunit Europea, che si avvale del contributo tecnico del Joint Research Centre di Ispra A livello europeo, dal 1990 esiste un database di vini che raccoglie dati da campioni di provenienza certa vinificati in Europa, secondo le indicazioni del Regolamento UE 2676/90. Oltre ai dati dei valori D/H originariamente previsti, attualmente il database comprende anche valori di 13C deletanolo e di 18O dellacqua di vino. Siccome le possibilit di adulterazione comprendono lutilizzo di mosti rettificati, zuccheri e prodotti vari da paesi del terzo mondo, si stanno raccogliendo dati anche da vini

provenienti da questi paesi Determinazione della provenienza Oltre allutilizzo nellidentificazione di sofisticazioni, lanalisi isotopica impiegata nella caratterizzazione dal punto geografico dei prodotti enologici. Come si detto in precedenza, infatti, uve cresciute in zone climaticamente diverse daranno vini in cui C, H e O (presenti in etanolo e acqua) avranno subito frazionamenti isotopici conseguentemente diversi Nella figura a fianco sono riportati i valori di 18O per vini provenienti da: Paesi europei caldi (Spagna, Portogallo) Paesi europei temperati (Francia, Italia) Paesi europei freddi e umidi (Germania, LeAustria) differenze risultano essere significative

Problemi nella determinazione della provenienza Per la determinazione della provenienza regionale, si possono utilizzare gli stessi parametri utili a identificare le adulterazioni, cio 13C e 18O di etanolo e acqua di vino. La base ovviamente il database UE. La determinazione per resa problematica dal fatto che i campioni incogniti possono essere stati soggetti ad adulterazione, rendendo difficile la collocazione allinterno del database. Inoltre le variazioni stagionali naturali possono essere significative (figura sotto - 18O di vini tedeschi della Franconia in annate diverse Una misura alternativa pu essere la determinazione del rapporto isotopico 15 14 dellazoto ( N/ N) dagli aminoacidi, che per pu essere influenzato dalladdizione di sali di ammonio per la fermentazione Lapproccio migliore sembra quindi essere un impiego di

pi variabili, sia isotopiche sia di altro genere Spettrometria di massa La spettrometria di massa una tecnica utilizzata per separare molecole cariche, cio ioni, in base alla loro massa o, pi correttamente, in base al rapporto massa/carica. Quindi una tecnica in grado di distinguere isotopi dello stesso elemento e di calcolarne i rapporti isotopici I rapporti isotopici degli elementi leggeri (H, O, C, N, S) sono misurati con la tecnica Isotope Ratio Mass Spectrometry (IRMS) mediante trasformazione in gas puri Per gli elementi pesanti (Pb, Sr) sono invece utilizzate la tecnica Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (ICP-MS) e la tecnica Thermal Ionization Mass Spectrometry (TIMS) nelle quali il campione trasformato in atomi e ioni Isotope Ratio Mass Spectrometry Nella tecnica Isotope Ratio Mass Spectrometer (IRMS) si utilizza uno spettrometro di massa avente sensibilit minore ma capacit di risoluzione e precisione assai pi elevata rispetto agli spettrometri convenzionali Lo spettrometro IRMS comprende tre parti fondamentali: una sorgente di ioni, un analizzatore di massa e un contatore di ioni

La sorgente di ioni ha lo scopo di ionizzare le molecole del campione (generalmente introdotto in forma gassosa) per interazione con un fascio di elettroni che causa la formazione di ioni positivi dai composti del campione Gli ioni positivi sono poi accelerati e condotti allinterno dellanalizzatore di massa, ovvero un campo elettromagnetico dove gli ioni sono separati a seconda del loro rapporto massa/carica (m/z) Infine gli ioni sono raccolti e contati da un rivelatore Principio di funzionamento Magnete Sorgente ionica m/z 2 (H2) m/z 3 (HD) m/z 4 (D2) Preparazione del campione Per effettuare la misura con la IRMS necessario convertire lelemento di interesse nel campione in forma gassosa Estrazione e purificazione del composto di interesse

Trasformazion e del composto di interesse in gas Esempio: determinazione del rapporto Estrazione alcol etilico dal vino Separazione e quantificazione con spettrometria di massa C/12C nel vino (alcol etilico) 13 Ossidazione e trasformazione dellalcol in CO2 Quantificazion e del rapporto 13 CO2/12CO2

Cosa si misura effettivamente? Idrogeno H2: masse 2, 3 2 = 1H1H 3 = 1H2D Carbonio ossidazione con O2 CO2: masse 44, 45, 46 44 = 12C16O16O 45 = 13C16O16O e 12C16O17O 46 = 13C16O17O e 12C17O17O Azoto N2: masse 28, 29, 30 28 = 14N14N 29 = 14N15N 30 = 15N15N Zolfo ossidazione con O2 SO2: masse 64, 66

64 = 32S16O16O 66 = 34S16O16O Specie misurate Esempi di strumenti Nelle figure sono riportati due esempi di spettrometri di massa per analisi IRMS. Si tratta generalmente di strumenti di costo elevato, accessibile soltanto a laboratori di analisi molto avanzati Molti spettrometri per analisi IRMS sono dotati anche di un gascromatografo per la separazione di specie organiche preliminare allanalisi degli isotopi

IMPORTANTE Scrivere meglio volatili Scrivere terpeni con cromatogrammi Scrivere esteri con cromatogrammi

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